对于CAR-T细胞来说,发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性的T细胞,CAR-T细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以CAR-T阳性细胞数表示的,因此,CAR转染阳性率是CAR-T细胞产品质量控制的必检项,监管部门建议应采用流式细胞法检测CAR转染阳性率。目前有针对CAR不同结构区域的检测方法,包括针对CAR抗原结合位点的,比如CD19抗原和抗独特型抗体,或针对轻链或铰链区的抗Fab抗体或Protein L蛋白,其中,针对抗原结合部位的CAR阳性率检测方法因其具有更好专属性而被广泛使用。本文将对CAR阳性表达率检测相关案例做一汇总以供大家参考。
试剂 | 检测机制 | 优势 | 劣势 |
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Protein L | 结合抗体κ轻链 | 具有一定的通用性,可检测不同靶点的CAR | 仅能识别人VκI VκIII和VκIV亚型和鼠VκI亚型,但不能识别人VκII亚型和鼠Ig的其他亚型轻链 |
Anti-Fab抗体 | 结合抗体Fab段 | 具有一定的通用性,可检测不同靶点的CAR | 背景值高,商品化产品质量参差不齐且多数为多抗,批间一致性较差 |
Anti-idiotype抗体 | 特异性结合scFv抗原识别区 | 高特异性、高灵敏度,低背景 | 少有商品化产品,需定制开发,定制周期较长(6个月左右) |
靶点蛋白 | 特异性结合scFv抗原识别区 | 具靶点专属性,可以评估CAR与靶标的结合能力 | 检测灵敏度受scFv与靶点蛋白间的亲和力限制 |
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案例名称 | 数据来源 |
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案例一 | 利用PE标记CD19蛋白检测anti-CD19 CAR 阳性表达率 | ACROBiosystems | 点击查看 |
案例二 | 利用PE标记BCMA蛋白检测anti-BCMA CAR 阳性表达率 | ACROBiosystems | 点击查看 |
案例三 | 利用FITC标记anti-FMC63 antibody检测anti-CD19(FMC63) CAR 阳性表达率 | ACROBiosystems | 点击查看 |
案例四 | 利用生物素标记hBCMA检测anti-BCMA CAR阳性表达率 | 深圳普瑞金 | 点击查看 |
案例五 | 利用生物素标记hCD19检测anti-CD19 CAR阳性表达率 | MacLeod DT | 点击查看 |
案例六 | 不同供应商hCD19, Fc tag蛋白的结合特异性验证 | ACROBiosystems | 点击查看 |
检测方法:流式细胞术
检测仪器:BD FACS Celesta流式细胞分析仪 (BD Biosciences)
样本信息:Anti-CD19 CAR-293细胞
主要试剂:
简要流程:
检测结果:结果显示Anti-CD19 CAR阳性表达率为100%
Protocol
检测方法:流式细胞术
检测仪器:BD FACS Celesta流式细胞分析仪 (BD Biosciences)
样本信息:Anti-BCMA CAR-293细胞
主要试剂:
简要流程:
检测结果:结果显示Anti-BCMA CAR阳性表达率为100%
Protocol
检测方法:流式细胞术
检测仪器:BD FACS Celesta流式细胞分析仪 (BD Biosciences)
样本信息:Anti-CD19 CAR-293细胞
主要试剂:
简要流程:
检测结果:结果显示Anti-CD19 CAR阳性表达率为100%
Protocol
应用案例由深圳普瑞金生物药业公司友情提供!
检测方法:流式细胞术
检测仪器:BD FACSCalibur流式细胞分析仪
样本信息:转染anti-BCMA CAR的人原代T淋巴细胞
主要试剂:
简要流程:
检测结果:结果显示1号患者anti-BCMA-CAR T细胞阳性率在52.72%,2号患者anti-BCMA-CAR T细胞阳性率在73.49%.
应用案例来自 MacLeod DT, et al., 2017, Mol Ther. 25(4):949-961.doi: 10.1016/j.ymthe.2017.02.005.
检测方法:流式细胞术
检测仪器:BD Fortessa flow cytometer (BD Biosciences)
样本信息:TRC1-2-treated, AAV:TRAC:CAR-transduced T cells
主要试剂:
简要流程:
检测结果:结果显示CD3阴性T细胞群中CD19 CAR表达的比例要高于CD3阳性T细胞群。
验证数据由ACRO应用开发团队自主研发提供!
检测方法:流式细胞术
细胞样本: R1013-C6 cells (过表达Anti-CD19[FMC63] scFv & RFP的Expi 293细胞);Expi 293 cells;Jurkat E6.1 cells.
主要试剂:
简要流程:
检测结果:结果显示ACROBiosystems的Human CD19 Protein, Fc Tag蛋白仅能特异性识别R1013-C6细胞表面的Anti-CD19[FMC63] scFv,不能与Expi 293细胞和Jurkat E6.1细胞发生非特异性结合反应;而同等实验条件下,Company N的Human CD19 Protein, Fc Tag蛋白与Expi 293细胞和Jurkat E6.1细胞发生了较强的非特异性结合。
Protocol
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