破解LER难题！低内毒素回收（LER）现象解析与缓解策略

内毒素（脂多糖，LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要组成成分，能够在人体内诱发强烈的致热反应和全身性炎症反应。基于重组C因子（rFC）试剂或鲎试剂（LAL）的细菌内毒素检测法（BET）被各国药典公认为注射用药物、生物制品及医疗器械中内毒素检测的金标准，包括USP <85>、USP <86>、EP 2.6.14和JP 4.01等[1,2,3,4]。然而，低内毒素回收（LER）现象的存在，尤其在复杂制剂体系中，已对BET方法的检测可靠性提出了严峻挑战。

LER现象最早由Chen和Vinther于2013年系统性报道，描述了在某些生物制品中，加标内毒素活性随时间推移而逐渐丧失、导致可检测信号下降的现象[3]。与传统BET方法中的抑制或增强干扰不同，LER具有稀释不可逆性和时间依赖性特征，使其更难被识别和有效控制[4]。包括美国FDA在内的监管机构已明确强调，在生物制品上市许可申请（BLA）过程中需开展LER持留时间（hold-time）研究，以确保药品在整个生命周期内内毒素的可检测性^[6]。

LER（低内毒素回收）被正式定义为：在既定的持留时间内，即使细菌内毒素检测法（BET）经验证不存在干扰，未稀释的药物制剂或制剂体系中加标内毒素的回收率仍低于50%[5]。若在两个连续时间点观察到加标回收率均低于50%，则可被视为LER发生的确凿证据[6]。

与直接影响LAL-内毒素反应过程的传统BET干扰不同，LER的本质在于内毒素脂多糖（LPS）结构发生改变，使其无法被LAL或rFC试剂有效识别，从而导致检测信号显著降低。

基于对现有文献的系统综述（包括PDA技术报告TR82、相关案例研究及各国药典数据），已确认LER的主要诱发因素如下：

螯合剂在药物制剂中常作为稳定剂或pH调节剂使用，典型代表包括EDTA、柠檬酸盐和磷酸盐。这类化合物可与二价阳离子（Mg²⁺、Ca²⁺）形成络合，而这些离子对于维持内毒素脂多糖（LPS）聚集体的结构稳定性至关重要[7]。其中，EDTA和柠檬酸盐被认为是最强的LER诱导因素：研究表明，EDTA浓度为0.1 mM时，或柠檬酸浓度在5–25 mM范围内，即可显著诱发LER现象^[8,9]。相比之下，磷酸盐缓冲体系也可能引起LER，但作用程度弱于柠檬酸盐，其机制主要是与LPS竞争二价阳离子，而非形成稳定的螯合物^[10]。

非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯20（Tween 20）和聚山梨醇酯80（Tween 80），在生物制剂配方中广泛用于抑制蛋白聚集。然而，这类表面活性剂可通过嵌入内毒素脂多糖（LPS）聚集体内部，破坏其超分子结构并形成混合胶束，从而加剧LER现象[7]。由于Tween 20具有更高的扩散能力及更短的脂肪酸链长度，其结构与大肠杆菌LPS中脂质A的酰基链更为匹配，因此其诱导LER的能力通常强于Tween 80[10]。研究表明，在单克隆抗体体系中，Tween 20浓度低至0.006%（w/v）时，即可在特定条件下诱发LER现象^[11]。

目前被广泛接受的LER机制认为，在同时含有螯合剂和表面活性剂的制剂体系中，LER通常遵循一个两步反应模型^[7,10]：

螯合剂可与二价阳离子结合，破坏维持LPS聚集体结构稳定的盐桥作用，降低LPS超分子结构的刚性，使其更易发生后续结构改变。

表面活性剂进一步嵌入已被削弱的LPS聚集体中，形成混合胶束或层状结构。这种结构重排会遮蔽LPS中的脂质A结构域，从而阻断其与LAL或rFC试剂的相互作用，最终导致可检测内毒素活性显著降低。

ACROBiosystems百普赛斯自主研发了LER样本稀释缓冲液，配套重组C因子内毒素检测试剂盒（Cat. NO. RES-A056），可有效缓解螯合剂或表面活性剂导致的内毒素掩蔽问题，确保复杂基质中内毒素的准确检测。基于终点荧光测定的rFC法，特异性高、批间一致性强，且无β-1,3-葡聚糖干扰，检测结果与传统LAL方法相当。rFC法无需依赖鲎资源，兼顾环保与可持续发展，满足制药、医疗器械及生物制品等行业对内毒素检测的严格质量控制要求。

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• 有效消除EDTA、Tween 20与Tween 80的干扰

当样本基质中EDTA浓度≥0.1 mM、Tween 20浓度≥0.01%，或Tween 80浓度≥0.05%时，将对内毒素检测产生显著干扰。采用内毒素检测用水进行稀释无法消除此类干扰，加标回收率偏离药典规定的50–200%范围。相比之下，使用LER样本稀释缓冲液可有效消除上述干扰，使加标回收率满足药典要求，从而确保检测结果的准确性与合规性。

使用无内毒素水与 LER 样品稀释缓冲液时，EDTA (A)、Tween 20 (B) 和 Tween 80 (C) 浓度对加标回收率的影响

• 有效缓解LER样本随时间存储的影响

既往研究表明，LER样本引起的检测干扰具有明显的时间依赖性，且随放置时间延长而逐渐增强。为模拟实际应用场景，将含不同浓度EDTA、Tween 20和Tween 80的基质样本在检测前24小时加入LER样本稀释缓冲液及5 EU/mL内毒素标准品进行预处理；同时设置另一组样本在检测当日加入相同试剂作为对照。结果显示，两组样本的检测值均与理论浓度一致，加标回收率始终保持在正常范围内，表明该缓冲液可有效抑制LER相关的时间依赖性干扰。

LER样本稀释缓冲液在含EDTA（A）Tween 20（B）Tween 80（C）样本中过夜孵育后仍可维持稳定的加标回收率。

LER是一种由螯合剂和表面活性剂诱导的复杂现象，其本质源于内毒素脂多糖（LPS）超分子结构的改变。本研究证实，LER可在水性体系中随时间自发发生；使用LER样本稀释缓冲液能够通过稳定LPS于可检测状态，有效缓解该效应。研究结果为药品质量控制提供了一种切实可行的解决方案，可确保细菌内毒素检测（BET）结果的可靠性，并降低内毒素污染未被检出的风险。

将LER缓冲液纳入BET检测流程，有助于满足监管合规要求，并进一步提升注射用药物及生物制品的患者用药安全性。

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