"膜杰作"—多次跨膜靶点蛋白开发技术平台及系列产品

跨膜蛋白是嵌入细胞膜磷脂双分子层中实现细胞内外跨越的一类蛋白,跨膜区域的相互作用是连接膜外环境与细胞内环境的重要渠道,以此来执行各种激活和应答反应实现信号转导,调控细胞内外的形态和功能上的改变。许多人类疾病或许都与异常的跨膜蛋白功能有关,跨膜蛋白的多功能性使它们成为理想的药物作用靶点
具有全长完整结构的多次跨膜蛋白具有重要意义,CD20为例,已有研究证实Rituximab对CD20的识别不止有一级表位ECL2,还识别其二级表位ECL1/ECL2,二级表位ECL1/ECL2还会影响Rituximab的CDC效应。然而,多次跨膜蛋白结构复杂,具有多个疏水跨膜区,往往在宿主细胞中表达水平极低。
针对多次跨膜蛋白的制备难点,ACROBiosystems百普赛斯构建了专业的多次跨膜蛋白研发与生产平台化解决方案,可满足多次跨膜蛋白在药物筛选、抗体开发及功能研究等不同应用场景的需求。我们提供种类齐全、结构完整的全长多次跨膜蛋白产品,包括:四次跨膜蛋白CD20Claudin18.2TM4SF5,五次跨膜蛋白CD133,六次跨膜蛋白STEAP1TRPV1,七次跨膜蛋白GPRC5DGLP-1RCCR8,十二次跨膜蛋白SLC7A11等。我们还可提供相应稳定细胞株及细胞株开发服务,助力药物开发及临床申报。欢迎咨询~

四大技术平台

VLP技术平台
VLP技术平台
技术原理

ACROBiosystems专门搭建了基于HEK293表达系统的VLP技术平台,将构象完整的膜蛋白直接聚集在细胞表面,使这些复杂的膜蛋白转变为可溶性的、高浓度的蛋白用于抗体免疫和筛选,所制备的包膜VLPs在其固有的细胞膜上显示正确折叠的多次跨膜蛋白,从而能够诱导和筛选识别靶标天然构象的功能性抗体。
ACROBiosystems除提供VLP技术平台下常规生产的多次跨膜蛋白之外,同时也接收 定制服务

独特优势
全长跨膜蛋白
VLP中靶抗原丰度高于过表达细胞
可提高免疫原性
100-300 nm,可作为树突状细胞和噬菌体展示的最佳靶点
可用于免疫/ELISA/SPR/BLI/细胞实验/CAR阳性率检测
膜蛋白-去垢剂技术平台
膜蛋白-去垢剂技术平台
技术原理

多次跨膜蛋白的跨膜区域疏水性较高,在普通的缓冲液中很难保持正确的构象,可以通过添加去垢剂解决该问题。以昆虫细胞表达技术和哺乳动物细胞表达技术为基础,ACROBiosystems专门搭建了困难药物靶点跨膜蛋白的表达平台和纯化平台,并且已经从常用的去垢剂中筛选出包括Detergent(货号DC-11)在内的几种效果很好的去垢剂,大大增加多次跨膜靶点蛋白的水溶性,帮助其在溶液中形成天然正确的构象。

独特优势
具有天然完整构象
可精确定量
可应用于免疫/ELISA/SPR/BLI
Nanodisc技术平台
Nanodisc技术平台
技术原理

“Nanodisc”的磷脂层结构,是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构,跨膜蛋白移除去垢剂后可以整合到Nanodisc的特殊结构中,保持其生物学活性并有很好的水溶性,应用更广泛。ACROBiosystems研发团队经过不断优化改进,已成功摸索出适用于工业化放大生产的Nanodisc组装工艺,实现了跨膜蛋白Nanodisc产品的长期稳定供货。

独特优势
处于近似天然膜环境中,全长的跨膜蛋白具有天然完整构象
全长的跨膜蛋白保持生物活性,可精确定量
具有良好的水溶性,无需去垢剂
可用于免疫/ELISA/SPR/BLI/细胞实验/CAR阳性率检测
Nanodisc-pro技术平台
Nanodisc-pro技术平台
技术原理

“Nanodisc-pro”技术平台采用创新的骨架原位组装策略,直接在跨膜蛋白的天然膜环境附近,利用骨架环绕包裹目标蛋白及其紧密相邻的天然磷脂,形成稳定的磷脂双分子层结构。该技术免除了传统方法中破坏性的去垢剂剥离与重组步骤,最大程度保留了跨膜蛋白的天然构象与活性。所获得的Nanodisc-pro产品不仅保持了跨膜蛋白的生物学功能,还具备优异的水溶性,应用广泛。

独特优势
处于天然膜环境中,全长跨膜蛋白具有天然完整构象,并保持生物活性
可精确定量,高批间一致性
具有良好的水溶性,无需去垢剂
可用于免疫/ELISA/SPR/BLI/细胞实验/CAR阳性率检测

产品列表

VLP平台
膜蛋白-去垢剂平台
Nanodisc平台
Nanodisc-pro平台
稳定细胞株

案例展示

以下ELISA&SPR数据均可免费提供内部实验操作方法以供参考,点击申请Protocol即可获取。

Claudin 18.2-VLP
Claudin18.2-VLP(CL2-H52P7
Claudin 18.2-VLP
经ELISA验证,全长Claudin18.2-VLP(CL2-H52P7)可与抗Claudin18.2抗体特异性结合,线性区间为0.2-3 ng/mL
Claudin 18.2-VLP

Immobilized Human Claudin-18.2 Full Length Protein-VLP (Cat. No. CL2-H52P7) at 5 μg/mL (100 μL/well) can bind Monoclonal Anti-Chimeric Claudin-18.2 Antibody, Human IgG1 with a linear range of 0.2-3 ng/mL (QC tested).

Protocol

经SPR验证, Claudin18.2-VLP(CL2-H52P7)可与抗Claudin18.2抗体特异性结合,亲和力常数为0.374 nM
Claudin 18.2-VLP

Human Claudin-18.2 Full Length Protein-VLP (Cat. No. CL2-H52P7) captured on CM5 Chip via Anti-Claudin-18.2 antibody can bind Anti-Claudin-18.2 antibody with an affinity constant of 0.374 nM as determined in a SPR assay (Biacore T200) (Routinely tested).

Protocol
经FACS验证,用Human Claudin18.2-VLP 蛋白(Cat. No. CL2-HF218)和阴性对照蛋白(Cat. No. VLP-NF2P4)分别结合转染Claudin18.2-CAR-293细胞,
结果表明,Claudin18.2-VLP 蛋白(Cat. No. CL2-HF218)可与Claudin18.2-CAR-293细胞特异性结合。
Claudin 18.2-VLP

2e5 of Anti-Claudin-18.2 CAR-293 cells were stained with 100 μL of 3 μg/mL of Fluorescent Human Claudin-18.2 Full Length Protein-VLP (Cat. No.CL2-HF218) and negative control protein respectively, FITC signals was used to evaluate the binding activity (QC tested).

Protocol

CD20-Detergent
经ELISA验证,全长CD20-Detergent(CD0-H52H3)可与利妥昔单抗(Rituximab)特异性结合,线性区间为0.4-3 ng/mL
CD20-Detergent

Immobilized Rituximab at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length Protein, His Tag (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-3 ng/mL (in presence of DDM and CHS) (QC tested).

Protocol

经ELISA验证,生物素标记全长CD20-Detergent(CD0-H82E5)可与利妥昔单抗(Rituximab)特异性结合,线性区间为4-63 ng/mL
CD20-Detergent

Immobilized Rituximab at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (Cat. No. CD0-H82E5) with a linear range of 4-63 ng/mL (in presence of DDM and CHS) (QC tested).

Protocol

经SPR亲和力验证,生物素标记全长CD20-Detergent(CD0-H82E5)可与利妥昔单抗(Rituximab)可与特异性结合,亲和力常数为1.73 nM
CD20-Detergent

Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (Cat. No. CD0-H82E5) captured on Biotin CAP-Series S Sensor Chip can bind Rituximab with an affinity constant of 1.73 nM as determined in a SPR assay (in presence of DDM and CHS) (Biacore T200) (QC tested).

Protocol
CD133-Nanodisc
经电泳(SDS-PAGE)验证, his标签的全长CD133-Nanodisc蛋白纯度高于90%
CD133-Nanodisc

Human CD133 Full Length, His Tag (Nanodisc) ((Cat. No. CD3-H52H1))on SDS-PAGE under reducing (R) condition. The gel was stained overnight with Coomassie Blue. The purity of the protein is greater than 90%.

经ELISA验证,全长CD133-Nanodisc(CD3-H52H1)可与抗人源CD133(133-3) 单克隆抗体特异性结合,线性区间为0.2-4 ng/mL
CD133-Nanodisc

Immobilized Human CD133 Full Length Protein, His Tag (Cat. No. CD3-H52H1) at 1 μg/mL (100 μL/well) can bind Monoclonal Anti-Human CD133 Antibody, Human IgG1 with a linear range of 0.2-4 ng/mL (QC tested).

Protocol

Claudin 6-Nanodisc-pro
经FACS验证,用Human Claudin 6-Nanodisc-pro蛋白(Cat. No. CL6-H52M3)转染Anti-Claudin-6(BBz) CAR-293细胞,结果表明,全长Claudin 6蛋白可与Anti-Claudin-6(BBz) CAR-293细胞特异性结合。
Claudin 6-Nanodisc-pro

Flow cytometric analysis of overexpressing Anti-Claudin-6(BBz) CAR-293 cells staining with Fluorescent Human Claudin-6 Full Length Protein, Flag,His Tag, GFP Tag (Cat. No. CL6-H52M3) (2e5 of Anti-Claudin-6(BBz) CAR-293 cells were stained with 100 μL of 5μg/mL of Fluorescent Human Claudin-6 Full Length Protein, Flag,His Tag,GFP Tag), compared with negative control protein analyzed with FACS (QC tested).

Protocol

经ELISA验证,荧光标记全长Claudin 6-Nanodisc-pro蛋白(CL6-H52M3)可与Anti-Human Claudin 6单克隆抗体特异性结合,线性区间为0.05-2 ng/mL
Claudin 6-Nanodisc-pro

Immobilized Fluorescent Human Claudin-6 Full Length Protein, Flag,His Tag,GFP Tag (Cat. No. CL6-H52M3) at 5 μg/mL (100 μL/well) can bind Monoclonal Anti-Human Claudin 6 antibody, Human IgG1 with a linear range of 0.05-2 ng/mL (QC tested).

Protocol

经SPR亲和力验证,荧光标记全长Claudin 6-Nanodisc-pro蛋白(CL6-H52M3)可与Anti-Human Claudin 6单克隆抗体特异性结合,亲和力常数为1.52 nM
Claudin 6-Nanodisc-pro

Anti-Claudin-6 Antibody, Human IgG1 captured on Protein A Chip can bind Fluorescent Human Claudin-6 Full Length Protein, Flag,His Tag,GFP Tag (Cat. No. CL6-H52M3) with an affinity constant of 1.52 nM as determined in a SPR assay (Biacore 8K) (Routinely tested).

Protocol

"膜杰作"Q&A

Q1:如何解读“膜杰作”?

"膜杰作"一方面是指平台,ACRO突破了技术难题,搭建了三大技术平台,为多次跨膜蛋白的成功研发提供了平台保障。另一方面,"膜杰作"是指ACRO依托于平台研发出的多次跨膜蛋白产品,具有全长、天然构象、稳定、高活性、覆盖多应用场景等杰出优势。 "杰",也是ACRO的"技术自信",以杰出的研发能力,服务于更好的生物医药。

Q2:想购买Claudin18.2做免疫和抗体筛选,怎么挑选?

我们制备的Claudin18.2有VLP平台下的版本,也有DDM/CHS平台下的Claudin18.2版本。两款都是可以的。不过免疫的话也可以优先选择VLP版本的,因为本身VLP可以提高免疫原性。筛选的话两款都是可以,如果想要得到准确的亲和力数据,推荐DDM/CHS版本(即去垢剂版本)。

Q3:抗体与抗原结合在胞外,全长的多次跨膜蛋白意义大吗?

多次跨膜蛋白在细胞膜上多次跨越,在胞外形成多个胞外区,比如Claudin18.2、CD20、CD133都有两个ECL(extracellular loops),每个ECL都有特定功能甚至会相互影响。全长可以保证蛋白构象天然完整,而且ECL展现完全,帮助筛选靶向多次跨膜蛋白抗原的理想抗体。给大家看下面两张图,全长的意义就显而易见了,结构完整,功能上也有保证。这么看,全长也不是我们ACRO一直在强调全长,而是客户需要全长的多次跨膜蛋白,满足客户需要的产品是ACRO的初衷。我们也比较过,单独的胞外ECL区蛋白活性确实比全长蛋白差。

多次跨膜蛋白就是要全长
Q4:VLP和Nanodisc平台下的多次跨膜蛋白怎么去除非特异抗体?

使用VLP或Nanodisc平台下的膜蛋白进行免疫时,可能产生针对VLP或Nanodisc的支架蛋白而非目标膜蛋白的非特异抗体,严重干扰特异性抗体的获得。为此,我们提供空白对照产品,用于高效反筛去除非特异抗体:
• VLP平台:两款空白对照(VLP-N5213, VLP-NF2P4)可识别由VLP引起的背景信号。
• Nanodisc平台:三款空白对照(APO-H51H3, APO-H81Q5, APC-HF1H3)可识别由Nanodisc引起的的背景信号。

Q5:相比其他非Nanodisc产品,Nanodisc有什么好处吗?

Nanodisc-膜蛋白与去垢剂-膜蛋白相比,的确有不同。首先,原理上,Nanodisc膜蛋白是将膜蛋白除去去垢剂之后组装在类细胞膜的Nanodisc上。其次,应用上,我们都知道,去垢剂会溶膜从而对细胞产生损伤,Nanodisc版本的膜蛋白因不含去垢剂,可以进一步扩展到用于细胞试验、CAR阳性率检测,应用范围是更广的。另外,我们ACRO使用的Nanodisc技术已经获得专利持有方的授权,在研发过程中是可以放心使用的。

Q6:如何确认VLP-Claudin18.2表达的是该目标蛋白,纯度如何评估?产品上的电镜图片,怎么确认颗粒上有该蛋白?

Claudin18.2-VLP 我们会通过anti-Claudin18.2特异性的抗体进行检测验证。纯度我们通过电泳/HPLC/DLS电镜进行评估。常规负染电镜因分辨率低是没办法看到VLP上是否有Claudin18.2的。

Q7:VLP相关蛋白能适合冻干保存吗?VLP的用于免疫有什么注意事项?比如能否乳化,对佐剂类型有没有要求?

包膜VLP产品我们目前都是液体-70°C保存,干冰发货;非包膜VLP我们是冻干保存的。VLP免疫主要是需要注意佐剂量的选择,因为VLP本身是可以增强免疫原性的,跟常规蛋白不同。

Q8: CD24,PD-1等,也有VLP产品?和Claudin18.2是一样的吗?包膜VLP和非包膜有什么区别?

CD24,PD-1本身属于可溶蛋白,不是多次跨膜蛋白,所以使用的是非包膜的VLP;而多次跨膜蛋白因为有疏水跨膜区,所以需要使用包膜VLP;两者的区别就是VLP的表面是否有磷脂双分子膜。

Q9:VLP和Nanodisc产品稳定性如何。冷冻长时间保存可以吗?

VLP和Nanodisc本身的稳定性是很好的,是可以在-70°C长期保存的。

Q10:定制的全长多次跨膜蛋白,多久能到货?

定制的话,VLP版本的膜蛋白预计需要6-8周;DDM/CHS去垢剂版本的膜蛋白需要进行多次跨膜靶点蛋白表达纯化条件摸索和去垢剂筛选,所以开发周期更长一些,需要8周以上;Nanodisc版本的膜蛋白是DDM/CHS的周期上再加4周左右。

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