【技术干货】基于高质量重组蛋白的双特异性抗体生物活性分析

双特异性抗体有不同的结构形式：类似IgG结构，非IgG结构，对称结构，非对称结构^【1】，等等……对于这些新型的结构，双特异性抗体的质量属性与PK/PD分析尤为重要。

FDA发布的2019版《Bispecific Antibody Development Programs Guidance for Industry》^【2】对于双特异性抗体的质量属性有以下描述：双特异性抗体的质量属性，例如抗原特异性；亲和力和on/off速率；亲合力（针对靶向同一细胞上两个分子的双特异性抗体）；效力与过程相关的杂质：聚集体，片段，同聚物；稳定性；半衰期可能会影响药理作用，应加以研究。

由于双特异性抗体可能以生物活性形式和非活性形式的混合物形式存在，因此要确定与PK/ PD评估最为相关的双特异性抗体形式，并开发可定量的、经过验证的多种测定方法。总的来说，还是定量总的、结合和未结合的双特异性抗体的水平。另外，由于双特异性抗体发挥了更多效能，较单抗来说，使用剂量可能会减少，所以需要建立灵敏度更高的活性方法。

双特异性抗体分析案例

基于早期的抗原-抗体亲和力检测，如亲和力和on/off速率，选择具有最佳亲和力、最佳功能和稳定性能最好的构建体，这点对于效应细胞-靶细胞构造的双特异性抗体特别重要。因为靶向CD3可能会过度活化T细胞和其他免疫细胞，导致过多的细胞因子被释放出来，在使用上会有安全性的考量，所以目前靶向CD3的抗体中，如果保有Fc区域，需要注意降低Fc与FcγR的结合，进而减少副作用的产生。

以ACROBiosystems基于蛋白结构分析和目标应用产品设计开发的CD3E&CD3D 1:1 异源二聚体的活性验证分析为例，我们用MALS验证了蛋白纯度，用SPR、ELISA assay等方法验证了蛋白与临床双特异性抗体CD3×BCMA（AMG420）的结合活性。

双特异性抗体药物的生物活性方法开发，如PK方法分析，因生物样本中含有游离的靶点或者抗药抗体的干扰，所以通常需要一个以上的方法进行表征。

Free A/B Assay：

分别针对其中一个功能区进行分析模式建立，可分别评估其功能区的活性及暴露，并考察ADA或游离靶点对相应功能区的影响，可用单臂抗原与通用型检测抗体进行方法建立，但该方案做临床PK方法开发可能会有基质效应影响或者存在空间位阻影响，因而灵敏度不高。

Total Assay：

总抗体分析模式将不受ADA及游离靶点的干扰，可针对双特异性抗体分子骨架部分进行方法建立，此模式有助于评价毒性暴露，可用通用型检测抗体（临床前）或者非竞争性抗独特型抗体（临床）进行方法建立。

图6 双特异性抗体（CTLA-4 x OX40）的Intact assay

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ACRO还可提供高质量一体化的SPR&BLI分子互作检测服务，已合作工业级科研用户逾百余家，助力多种抗体药物申报临床阶段。