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最新CAR-T表达阳性率检测案例解析

2017-11-27 17:30

今年两款重磅CAR-T疗法,即诺华公司用于治疗25岁以下青少年难治或复发B细胞急性淋巴白血病的Kymriah和Kite Pharma公司用于治疗特殊类型成人大B细胞淋巴瘤的Yescarta,相继获美国FDA批准上市,让CAR-T细胞疗法产业化前景更加光明,也使得越来越多的企业纷纷布局这个领域,根据ClinicalTrials的数据, 目前全球CAR-T临床研究项目已超过400个。


CAR-T细胞作为一种“活的药物”,其制备流程复杂,质控环节众多。CAR-T表达阳性率的检测作为CAR-T疗法质量控制的重要一环,目前尚无标准的检测方案。据了解,企业内部常用的检测方案有利用Protein L、Anti-Fab抗体或靶点蛋白结合流式细胞术进行检测,其中靶点蛋白结合流式细胞术的检测方案因其特异性强的优势而备受业界人士的青睐。在法规尚不完全明朗的今天,很多业内人士预期靶点特异性的检测将会被CFDA纳入CAR-T质量控制监管考量的范畴。今天小编为大家带来的正是利用靶点蛋白结合流式细胞技术检测CAR-T表达阳性率的真实案例解析,以供大家参考。


案例一:anti-BCMA CAR表达阳性率检测


检测数据由深圳普瑞金生物药业公司友情提供!非常感谢!


检测方法:流式细胞术

检测仪器:BD FACSCalibur流式细胞分析仪

样本信息:转染anti-BCMA CAR的人原代T淋巴细胞

主要试剂:

  • 生物素标记的BCMA蛋白 (Biotinylated Human BCMA / TNFRSF17 Protein, Fc Tag, Avi Tag (Avitag™), ACROBiosystems, Cat.No.BC7-H82F0)

  • PE标记的链霉亲和素(PE-SA,Biolegend, Cat.No.405204)

检测流程:

1. 构建anti-BCMA CAR 慢病毒载体,转染患者自体T淋巴细胞,转染3天后收集细胞,并用含2% BSA的PBS缓冲液洗两次;

2. 进行细胞计数,取 1*106个转染后的T细胞加入每个离心管中;

3. 向每个加入细胞的离心管中加入50ul生物素标记的BCMA蛋白(ACROBiosystems, Cat.No.BC7-H82F0),4℃孵育30分钟,生物素标记的BCMA蛋白终浓度为8ug/ml;

4. 30min 后,离心后弃去上清,用含2% BSA的PBS缓冲液清洗细胞两次;

5. 每管加入50ul PE标记的链霉亲和素(Biolegend, Cat.No.405204),4℃孵育30分钟, PE标记的链霉亲和素的稀释比例为1:50;

6. 30min后,离心并弃去上清,用含2% BSA的PBS缓冲液清洗细胞两次;

7. 每管加入400ul PBS中重悬细胞,用BD FACSCalibur流式细胞分析仪进行检测分析。

检测结果:

结果显示1号患者anti-BCMA-CAR T细胞阳性率在52.72%,2号患者anti-BCMA-CAR T细胞阳性率在73.49%.



图1 流式细胞术分析anti-BCMA-CAR T表达阳性率


案例二:anti-CD19 CAR表达阳性率检测


检测数据由ACRO应用开发团队自主研发提供!非常感谢!


检测方法:流式细胞术

检测仪器:NovoCyteTM Flow Cytometer, ACEA Biosciences

样本信息:R1013-C6细胞(过表达Anti-CD19[FMC63] scFv & RFP tag的293F细胞)

主要试剂:

  • 生物素标记的CD19蛋白 (Biotinylated Human CD19, Fc Tag , ultra sensitivity (primary amine labeling), ACROBiosystems, Cat.No.CD9-H8259)

  • FITC标记的链霉亲和素(FITC-SA,Biolegend, Cat.No.405201)

检测流程:

1. 用含10% FBS的DMEM培养基培养R1013-C6细胞,37℃,5% CO2培养箱中;

2. 收集细胞,并用含2% BSA的PBS缓冲液清洗细胞1次;

3. 计数细胞,取2*105个R1013-C6细胞加入每个离心管中;

4. 每管加入100ul生物素标记的CD19蛋白(ACROBiosystems, Cat.No.CD9-H8259),混匀后在4℃孵育1小时,生物素标记的CD19蛋白终浓度为10ug/ml;

5. 离心并弃去上清,用含2% BSA的PBS缓冲液清洗细胞1次;

6. 每管加入100ul 稀释的FITC标记的链霉亲和素(Biolegend, Cat.No.405201),混匀后4℃孵育1小时, FITC标记的链霉亲和素的稀释比例为1:500;

7. 离心后弃去上清,用含2% BSA的PBS缓冲液清洗细胞三次;

8. 每管加入100ul PBS重悬细胞,使用NovoCyteTM Flow Cytometer流式细胞分析仪进行检测分析。

检测结果

结果显示生物素标记的CD19蛋白能够与 R1013-C6细胞膜表面的anti-CD19 CAR 特异性结合,这种结合能够被游离的抗CD19的抗体FMC63拮抗。

图2 流式细胞术分析anti-CD19 CAR表达阳性率




ACROBiosystems作为专注于医药研发领域的蛋白供应商,利用其专业的蛋白研发平台和生物素标记平台,开发了一系列适用于特异性检测CAR表达阳性率的CAR-T靶点蛋白,其中生物素预先标记的蛋白在Biopanning筛选scFv,以及流式细胞技术检测CAR表达和筛选CAR表达的细胞中独具优势。




产品发布:


靶点

适应症

推荐产品

BCMA

多发性骨髓瘤、白血病、B细胞淋巴瘤

BC7-H82F0 (Biotinylated Human BCMA)

BCA-H522Y (Human BCMA)

CD19

急性白血病、B细胞淋巴瘤

CD9-H8259 (Biotinylated Human CD19)

ROR1

白血病,乳腺癌

RO1-H821y (Biotinylated Human ROR1)

RO1-H522y (Human ROR1)

CD33

急性髓系白血病

CD3-H82E7 (Biotinylated Human CD33)

CD3-H5226 (Human CD33)

EGFRVIII

胶质母细胞瘤

EGR-H82E0 (Biotinylated Human  EGFRVIII)

EGI-H52H4  (Human EGFRvIII)

CD30

白血病,B细胞淋巴瘤

CD0-H82E6 (Biotinylated Human CD30)

CD0-H5229 (Human CD30)

EGFR

非小细胞肺癌,上皮癌、胶质瘤

EGR-H82E3 (Biotinylated Human EGFR)

EGR-H5222 (Human EGFR)

FOLR1

卵巢癌

FO1-M82E9 (Biotinylated Mouse FOLR1)

FO1-H5229 (Human FOLR1)

HER2

卵巢癌,乳腺癌,胶质母细胞瘤,骨肉瘤

HE2-H822R (Biotinylated Human Her2)

HE2-H5225 (Human Her2)

c-MET/HGFR

恶性黑色素瘤,乳腺癌

MET-H82E1 (Biotinylated Human HGF R)

MET-H5227 (Human HGF R)

CAIX

肾细胞癌

CA9-H5226 (Human CA9  (38-414))

CD20

白血病,B细胞淋巴瘤

CD0-H5268 (Human MS4A1 / CD20, Fc Tag)

CD22

白血病,B细胞淋巴瘤

SI2-H5228 (Human Siglec-2 / CD22)

EpCAM

肝肿瘤,胃肿瘤

EPM-H82E8 (Biotinylated Human EpCAM)

EPM-H5223 (Human EpCAM)

GPC3

原发性肝细胞癌

GP3-H5223 (Human Glypican 3)

IL13Rα2

胶质瘤

IL2-H5257 (Human IL13Rα2, Fc Tag)

MSLN

间皮瘤,卵巢癌

MSN-H82E9 (Biotinylated Human MSLN)

MSN-H5223 (Human MSLN)

MUC1

精囊癌

MU1-H5252 (Human MUC-1, Fc Tag)

CD138

多发性骨髓瘤

SD1-H5228 (Human Syndecan-1 / CD138)

CD38

B细胞恶性肿瘤

CD8-H82E7 (Biotinylated Human CD38)

CD8-H5224 (Human CD38)


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